什么是CETSA细胞热迁移实验Cellular Thermal Shift Assay, CETSA是一种在细胞水平上研究小分子药物与靶蛋白相互作用的热稳定性检测方法。该方法最早由Martinez Molina等人于2013年提出将传统的热迁移实验从纯蛋白体系拓展到复杂的细胞环境中能够更真实地反映药物在细胞内的靶点结合情况。其基本原理是药物与目标蛋白结合后通常会提高蛋白的热稳定性使蛋白在更高温度下仍不易发生聚集或变性。通过检测不同温度处理后溶液中剩余可溶性蛋白的含量即可判断药物是否与靶点发生了结合。以下以贴壁细胞为例详细介绍CETSA的标准实验步骤。一、细胞给药处理细胞培养将目标细胞接种于10 cm培养皿中培养至融合度达到80%–90%处于对数生长期状态良好。加药处理分别向培养皿中加入等体积的溶剂对照DMSO和研究化合物终浓度建议为20 µM。轻轻混匀后继续在细胞培养箱中孵育1–2小时。药物处理时间可根据靶点特性或预实验进行调整。提示建议设置多个药物浓度梯度或不同处理时间以便获得更全面的结合信息。二、细胞收集与重悬收集细胞弃去培养上清用预冷的PBS轻柔洗涤细胞1–2次。加入适量胰酶消化细胞若为非贴壁细胞则直接收集用完全培养基终止消化。将细胞悬液转移至15 mL离心管中。离心300 × g 离心5分钟弃上清。重悬用含有蛋白酶抑制剂的PBS重悬细胞沉淀蛋白酶抑制剂可防止蛋白降解推荐使用cocktail型抑制剂。计数与归一取少量细胞悬液进行计数。将所有样品的细胞数目调整至一致例如1×10⁶个细胞/样本再次离心后用300 µL含蛋白酶抑制剂的PBS重悬细胞。关键点保证各组细胞数目相同后续加热处理及定量分析才具有可比性。三、温度梯度加热处理分装将重悬后的细胞悬液均匀分装至6–8个PCR管中每管约40–50 µL具体体积取决于后续检测需求。设置温度梯度首次实验建议采用较宽的温度范围和适当的温度间隔以确定蛋白的熔解曲线。例如40℃、44℃、48℃、52℃、56℃、60℃、64℃等也可根据目标蛋白的已知热稳定性调整。加热操作将PCR管放入预先设定好温度的热循环仪或恒温金属浴中。达到目标温度后精确加热3分钟。加热结束后立即将PCR管取出并迅速浸入液氮中速冻使蛋白状态“锁定”。逐管完成按照设定的温度梯度依次处理每个样品。注意不同温度管的处理顺序可以随机或从低到高但每管的加热时间必须严格控制为3分钟。⚠️注意速冻步骤非常关键务必快速完成避免蛋白在降温过程中发生构象恢复或进一步聚集。四、反复冻融裂解解冻所有样品完成加热及速冻后取出PCR管在室温约25℃下解冻。涡旋待样品完全融化后短暂涡旋振荡约5秒使细胞充分裂解。重复冻融将样品再次放入液氮中速冻然后再次室温解冻并涡旋。此“冻融-涡旋”循环共重复2次即总共3次冻融。这一步骤有助于破坏细胞膜和细胞器膜释放可溶性蛋白。五、离心分离与WB检测离心将反复冻融后的样品在4℃下以20,000 × g离心20分钟。离心后未变性的可溶性蛋白保留在上清中而热变性聚集的蛋白及细胞碎片则沉淀于管底。吸取上清小心吸取上清液至新的离心管中尽量避免吸到底部沉淀。蛋白定量可选可采用BCA法测定上清总蛋白浓度以便等量上样。Western Blot检测向上清中加入适量蛋白上样缓冲液含还原剂煮沸变性后进行SDS-PAGE电泳转移至PVDF或NC膜使用目标蛋白的特异性抗体进行免疫印迹检测。结果分析通过比较DMSO对照与药物处理组在不同温度下目标蛋白条带的灰度值可绘制熔解曲线。若药物与蛋白结合通常会使蛋白的熔解温度Tm升高表现为在较高温度下仍有较多的可溶性蛋白存在。六、实验注意事项蛋白酶抑制剂整个实验过程中PBS缓冲液中应始终添加蛋白酶抑制剂如PMSF、cocktail以防止内源性蛋白酶降解目标蛋白。对照组设计必须设置溶剂对照DMSO组且药物处理组的DMSO终浓度应与对照组一致通常≤0.1%–0.5%。温度梯度优化不同蛋白的热稳定性差异很大首次实验建议尝试较宽范围如37–75℃后续再根据结果缩小温度区间、加密温度点。样品保存加热并速冻后的样品可暂存于-80℃冰箱待所有样品收集完毕后统一进行后续处理。七、常见问题与解决方案问题可能原因建议所有温度条带均很弱细胞数目不足或抗体灵敏度低增加细胞量或使用信号放大检测体系对照组与药物组无差异药物未结合靶点靶点热稳定性变化小调整药物浓度或处理时间尝试其他温度范围上清中蛋白量过低裂解不充分或离心力不足增加冻融次数确保离心速度和时间足够背景过高抗体非特异性结合优化封闭条件使用更特异的抗体通过CETSA实验研究者可以在接近生理状态的细胞环境中快速判断候选化合物是否与目标蛋白发生相互作用是药物靶点验证和机制研究的有力工具。希望本protocol能为您的实验提供清晰指导。参考文献Jafari R, Almqvist H, Axelsson H, Ignatushchenko M, Lundbäck T, Nordlund P, Martinez Molina D. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nat Protoc. 2014 Sep;9(9):2100-22. doi: 10.1038/nprot.2014.138. Epub 2014 Aug 7. PMID: 25101824.